Minerva Super Fusion Cloning Kit

簡(jiǎn)要描述：Minerva Super Fusion Cloning Kit（無(wú)縫克隆試劑盒）

產(chǎn)品貨號： M2026L

產(chǎn)品規格：10 μL× 50T

儲存條件：-20℃保存，有效期見(jiàn)外包裝。

產(chǎn)品型號： M2026L

所屬分類(lèi)：分子生物學(xué)

更新時(shí)間：2024-05-23

Minerva Super Fusion Cloning Kit（無(wú)縫克隆試劑盒） 

產(chǎn)品貨號： M2026L 

產(chǎn)品規格：10 μL× 50T 

儲存條件：-20℃保存，有效期見(jiàn)外包裝。

產(chǎn)品介紹：無(wú)縫克隆是一種簡(jiǎn)單、快速并且高效的 DNA 定向克隆技術(shù)，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通過(guò)識別 DNA 片段和線(xiàn) 性化載體末端的 15-25 bp 同源序列，50℃反應 15-60 min 即可將 DNA 片段和線(xiàn)性化載體高效精確地融合在一起， 完成定向克隆，且克隆陽(yáng)性率可達 95%以上。 

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 簡(jiǎn)單、快速、高效，可將插入片段克隆至任意線(xiàn)性載體 的任意位點(diǎn)； 

2. 不依賴(lài)于連接酶，無(wú)載體自連，陽(yáng)性率可達 95%以上； 

3. 無(wú)需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)； 

4. 一次反應可完成單至多個(gè)片段重組。

使用方法：

一． 制備線(xiàn)性化克隆載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對載體進(jìn)行線(xiàn)性化，線(xiàn)性化載體 可以通過(guò)酶切或者反向 PCR 擴增完成。 

（1）酶切制備 雙酶切：線(xiàn)性化，轉化背景（假陽(yáng)性克?。┑?； 單酶切：線(xiàn)性化程度差，可通過(guò)適當延長(cháng)酶切時(shí)間來(lái)減 少環(huán)狀質(zhì)粒的殘留。 注：（1）雙酶切無(wú)需去磷酸化，單酶切需要去磷酸化； （2）酶切完成后，應將快速內切酶失活或對目的產(chǎn)物純化后再用于重 組反應。 （2）反向 PCR 擴增制備 載體質(zhì)粒 DNA 為模板，克隆位點(diǎn)為分界點(diǎn)，設計一對 反向引物，推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴增。

二． 設計插入 PCR 引物片段 PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段（插入片段或 載體）末端同源的 15~25 nt（推薦 18 nt）序列。假如載體 為粘性末端，且 3’端突出，則引物設計必須包含突出部分； 若 5’端突出，則引物設計可以包含突出部分，也可以不包含。 插入片段擴增引物： 5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+基因特 異性正向擴增序列—3’ 3’—基因特異性反向擴增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游 載體末端同源序列—5’

注：盡量選擇無(wú)重復序列且 GC 含量均勻的區域進(jìn)行克隆，當載體克隆 位點(diǎn)上下游 25 nt 區域內 GC 含量為 40~60%時(shí)，重組高

三． 插入片段的 PCR 擴增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 擴增， 無(wú)需考慮產(chǎn)物末端有無(wú) A 尾 (重組過(guò)程中將被去除， 在最 終質(zhì)粒中不會(huì )出現)。 建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴增以減 少擴增突變的發(fā)生。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫 克隆反應，若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴 增產(chǎn)物，可直接可用于無(wú)縫克隆反應，但加樣的體積不宜超 過(guò)反應總體積的 20% 。

四．無(wú)縫克隆反應：

1. 冰水浴中配制以下反應體系：1.最適載體用量（ng）= 0.02×載體堿基對數，即 0.03 pmol。 2 插入單片段時(shí)，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數；插入多 片段時(shí)，每片段量（ng）= 0.02×片段堿基對數。 注：（1）如果插入的單片段長(cháng)度大于載體，那么應互換載體與插入片段 用量； （2）如果插入的片段長(cháng)度小于 200 bp，那么要使用 5 倍載體的用量； （3）如果按上述公式計算得到的用量低于低/高于最高值，那么建議 直接按低/最高用量使用； （4）載體或插入片段過(guò)長(cháng)，片段數量過(guò)多，均會(huì )降低陽(yáng)性率。 體系配制完成后，輕輕吹吸數次混勻各組分，避免產(chǎn)生 氣泡即可，切勿渦旋。

2. 將反應體系置于 50℃，反應 15-60 min。 注：（1）推薦使用溫控比較精準的儀器進(jìn)行反應，如 PCR 儀，反應時(shí) 間不足或過(guò)長(cháng)都會(huì )降低克隆效率； （2）當載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上時(shí)，建議延長(cháng)反 應時(shí)間到 30~60 min； （3）50℃反應完成后，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心，將反應液收集至管底。 3. 將反應液離心管置于冰水浴中冷卻，直接進(jìn)行轉化或儲 存于-20℃。 注：-20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內使用。 

五． 克隆產(chǎn)物轉化 在 100 μL 感受態(tài)細胞中加入 5-10 μL 反應液，輕柔吹 吸混勻，置于冰上 30 min。42℃熱激 45~60s，冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培養基，37℃振蕩培養 40-60 min （200 rpm）。將菌液均勻涂布在含相應抗生素的平板上，倒 置于 37℃培養箱培養過(guò)夜。 注：（1）不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽(yáng)性率會(huì )有所差別，推 薦使用轉化效率>108 cfu/μg 的感受態(tài)細胞； （2）PCR 產(chǎn)物與線(xiàn)性化載體的數量和純度決定了菌落數； （3）陽(yáng)性對照平板通常生長(cháng)大量白色單菌落，陰性對照平 板只生長(cháng)很少的菌落。 

六． 陽(yáng)性克隆檢測菌落 PCR 鑒定：挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻， 95℃裂解 10 min，取 1 μL 作模板，進(jìn)行菌落 PCR 鑒定，推薦使用 UE 2×Taq PCR Master Mix（Green）（S2045）。 酶切鑒定：將單菌落接種到抗性培養基中培養過(guò)夜，提 取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

注意：（1）建議菌落 PCR 時(shí)，至少使用一條通用引物，可有效避免假 陽(yáng)性結果； （2）必要時(shí)可進(jìn)一步對陽(yáng)性結果進(jìn)行測序鑒定