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簡(jiǎn)要描述:Minerva Super Fusion Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒) 產(chǎn)品貨號: M2026L 產(chǎn)品規格:10 μL× 50T 儲存條件:-20℃保存,有效期見(jiàn)外包裝。
產(chǎn)品型號: M2026L
所屬分類(lèi):分子生物學(xué)
更新時(shí)間:2024-05-23
Minerva Super Fusion Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒)
產(chǎn)品貨號: M2026L
產(chǎn)品規格:10 μL× 50T
儲存條件:-20℃保存,有效期見(jiàn)外包裝。
產(chǎn)品介紹:無(wú)縫克隆是一種簡(jiǎn)單、快速并且高效的 DNA 定向克隆技術(shù),可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通過(guò)識別 DNA 片段和線(xiàn) 性化載體末端的 15-25 bp 同源序列,50℃反應 15-60 min 即可將 DNA 片段和線(xiàn)性化載體高效精確地融合在一起, 完成定向克隆,且克隆陽(yáng)性率可達 95%以上。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1. 簡(jiǎn)單、快速、高效,可將插入片段克隆至任意線(xiàn)性載體 的任意位點(diǎn);
2. 不依賴(lài)于連接酶,無(wú)載體自連,陽(yáng)性率可達 95%以上;
3. 無(wú)需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn);
4. 一次反應可完成單至多個(gè)片段重組。
使用方法:
一. 制備線(xiàn)性化克隆載體
選擇合適的克隆位點(diǎn),對載體進(jìn)行線(xiàn)性化,線(xiàn)性化載體 可以通過(guò)酶切或者反向 PCR 擴增完成。
(1)酶切制備 雙酶切:線(xiàn)性化,轉化背景(假陽(yáng)性克?。┑?; 單酶切:線(xiàn)性化程度差,可通過(guò)適當延長(cháng)酶切時(shí)間來(lái)減 少環(huán)狀質(zhì)粒的殘留。 注:(1)雙酶切無(wú)需去磷酸化,單酶切需要去磷酸化; (2)酶切完成后,應將快速內切酶失活或對目的產(chǎn)物純化后再用于重 組反應。 (2)反向 PCR 擴增制備 載體質(zhì)粒 DNA 為模板,克隆位點(diǎn)為分界點(diǎn),設計一對 反向引物,推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴增。
二. 設計插入 PCR 引物片段 PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段(插入片段或 載體)末端同源的 15~25 nt(推薦 18 nt)序列。假如載體 為粘性末端,且 3’端突出,則引物設計必須包含突出部分; 若 5’端突出,則引物設計可以包含突出部分,也可以不包含。 插入片段擴增引物: 5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)(可選)+基因特 異性正向擴增序列—3’ 3’—基因特異性反向擴增序列+酶切位點(diǎn)(可選)+下游 載體末端同源序列—5’
注:盡量選擇無(wú)重復序列且 GC 含量均勻的區域進(jìn)行克隆,當載體克隆 位點(diǎn)上下游 25 nt 區域內 GC 含量為 40~60%時(shí),重組高
三. 插入片段的 PCR 擴增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 擴增, 無(wú)需考慮產(chǎn)物末端有無(wú) A 尾 (重組過(guò)程中將被去除, 在最 終質(zhì)粒中不會(huì )出現)。 建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴增以減 少擴增突變的發(fā)生。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫 克隆反應,若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴 增產(chǎn)物,可直接可用于無(wú)縫克隆反應,但加樣的體積不宜超 過(guò)反應總體積的 20% 。
四.無(wú)縫克隆反應:
1. 冰水浴中配制以下反應體系:1.最適載體用量(ng)= 0.02×載體堿基對數,即 0.03 pmol。 2 插入單片段時(shí),最適片段用量(ng)= 0.04×片段堿基對數;插入多 片段時(shí),每片段量(ng)= 0.02×片段堿基對數。 注:(1)如果插入的單片段長(cháng)度大于載體,那么應互換載體與插入片段 用量; (2)如果插入的片段長(cháng)度小于 200 bp,那么要使用 5 倍載體的用量; (3)如果按上述公式計算得到的用量低于低/高于最高值,那么建議 直接按低/最高用量使用; (4)載體或插入片段過(guò)長(cháng),片段數量過(guò)多,均會(huì )降低陽(yáng)性率。 體系配制完成后,輕輕吹吸數次混勻各組分,避免產(chǎn)生 氣泡即可,切勿渦旋。
2. 將反應體系置于 50℃,反應 15-60 min。 注:(1)推薦使用溫控比較精準的儀器進(jìn)行反應,如 PCR 儀,反應時(shí) 間不足或過(guò)長(cháng)都會(huì )降低克隆效率; (2)當載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上時(shí),建議延長(cháng)反 應時(shí)間到 30~60 min; (3)50℃反應完成后,建議進(jìn)行瞬時(shí)離心,將反應液收集至管底。 3. 將反應液離心管置于冰水浴中冷卻,直接進(jìn)行轉化或儲 存于-20℃。 注:-20℃儲存的重組產(chǎn)物,建議在 1 周內使用。
五. 克隆產(chǎn)物轉化 在 100 μL 感受態(tài)細胞中加入 5-10 μL 反應液,輕柔吹 吸混勻,置于冰上 30 min。42℃熱激 45~60s,冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培養基,37℃振蕩培養 40-60 min (200 rpm)。將菌液均勻涂布在含相應抗生素的平板上,倒 置于 37℃培養箱培養過(guò)夜。 注:(1)不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽(yáng)性率會(huì )有所差別,推 薦使用轉化效率>108 cfu/μg 的感受態(tài)細胞; (2)PCR 產(chǎn)物與線(xiàn)性化載體的數量和純度決定了菌落數; (3)陽(yáng)性對照平板通常生長(cháng)大量白色單菌落,陰性對照平 板只生長(cháng)很少的菌落。
六. 陽(yáng)性克隆檢測菌落 PCR 鑒定:挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻, 95℃裂解 10 min,取 1 μL 作模板,進(jìn)行菌落 PCR 鑒定,推薦使用 UE 2×Taq PCR Master Mix(Green)(S2045)。 酶切鑒定:將單菌落接種到抗性培養基中培養過(guò)夜,提 取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
注意:(1)建議菌落 PCR 時(shí),至少使用一條通用引物,可有效避免假 陽(yáng)性結果; (2)必要時(shí)可進(jìn)一步對陽(yáng)性結果進(jìn)行測序鑒定
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